一、简要说明
GB 4789.35-2023于2023年9月6日发布，将于2024年3月6日实施。新标准中不但对正文内容做了一些变动：
增加了实时荧光PCR方法为选做方法；
修改了乳酸菌的定义、样品制备和培养时间；
修改了嗜热链球菌和乳杆菌计数方法的描述；
修改了部分培养基成分、储备液浓度和制备方法。
同时对两个重要的培养基（MRS和MC）成分和名称也做了改动，引入了三个新产品（稀释液、DNA提取液、10×PCR缓冲液），另外对两款生化管的名字也做了调整。
现将变动内容进行详细比较，方便操作人员正确选用产品和进行试验操作。
二、详细比较
新版标准（2023版）相对旧版标准（2016版）变更的内容详细列举如表1。
表1 新旧标准变更内容详细比较表格
序号 | 章节 | 原内容（GB 4789.35-2016） | 章节 | 变更内容（GB 4789.35-2023） | ||||||
1 | 术语和定义 | 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和嗜热链球菌属（Streptococcus）。
| 术语和定义 | 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称，不能液化明胶、不产生吲哚、革兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性、硝酸还原酶阴性及细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和嗜热链球菌（Stre ptococcus thermophilus)。 | ||||||
2 | 设备和材料 | 恒温培养箱：36℃±1℃。 冰箱：2℃~5℃。 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 天平：感量0. 01 g。 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 无菌吸管：1mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL | 设备和材料 | 恒温培养箱：36°C士1°C。 厌氧培养装置：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。 冰箱：2°C~8°C。 均质器及无菌均质袋均质杯或灭菌乳钵。涡旋混匀仪。 电子天平：感量0.001 g。 实时定量PCR仪。恒温水浴锅或金属浴。 离心机：离心力> 10 000Xg。 无菌试管：18 mmX180 mm.15 mmX100 mm。 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）10 mL（具0.1 mL刻度）。 微量移液器和灭菌吸头：2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。无菌平皿：直径90 mm。 PCR管。 | ||||||
3 | 培养基和试剂 | 4.1生理盐水：见A.1。 4.2MRS（ManRogosaSharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培养基：见A.2和A.3。 4.3 MC 培养基（ ModifiedChalmers 培养基）：见A.4。 4.4 0.5%蔗糖发酵管：见A.5。 4.4 0.5%纤维二糖发酵管：见A.5。 4.6 0.5%麦芽糖发酵管：见A.5。 4.7 0.5% 甘露醇发酵管：见A.5。 4.8 0.5%水杨苷发酵管：见A.5。 4.9 0.5%山梨醇发酵管：见A.5。 4.10 0.5% 乳糖发酵管：见A.5。 4.11七叶苷发酵管：见A.6。 4.12革兰氏染色液：见A.7。 4.13莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。 4.14半胱氨酸盐酸盐（CysteineHydrochloride）：纯度>99%。 | 培养基和试剂 | 4.1 稀释液：见附录A中A.1 4.2 MRS（Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基：见附录A中A.2。 4.3莫匹罗 星锂盐（Li-Mupirocin)和半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）改良MRS琼脂培养.基：见附录A中A.3。 4.4 MC（Modified Chalmers）琼脂培养基：见附录A中A.4。 4.5 0.5%蔗糖发酵管：见附录A中A.5。 4.6 0.5%纤维二糖发酵管：见附录A中A.5。 4.7 0.5%麦芽糖发酵管：见附录A中A.5。 4.8 0.5%甘露醇发酵管：见附录A中A.5。 4.9 0.5%水杨苷发酵管：见附录A中A.5。 4.10 0.5%山梨醇发酵管：见附录 A中A.5。 4.11 0.5%乳糖发酵管：见附录A中A.5。 4.12七叶苷发酵管：见附录A中A.6。 4.13 革兰氏染色液：见附录A中A.7。 4.14生理盐水：见附录A中A.8。 4.15 DNA提取液：见附录A中A.9。 4.16 10XPCR缓冲液：见附录A中A.10。 4.17莫匹罗星锂盐(C26H43O9Li）：化学纯。 4.18半胱氨酸盐酸盐(C3H8CINO2S）：纯度> 99%。 4.19 dNTPs。4.20 Taq DNA聚合酶：5 U/pL。 4.21 七种乳酸菌引物探针。 4.22 灭菌去离子水。 | ||||||
4 | 检验程序 |
| 检验程序 |
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5 | 样品制备 | / | 样品制备 | 新增：（1）6.1.2稀释液在试验前应在36℃士1℃条件下充分预热15 min~30 min。 （2）6.1.6经特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌食品样品应在相应技术/工艺要求下进行有效前处理。 更改：（1）样品稀释改用稀释液。 （2）样品处理均质参数改为：8 000×g~10 000×g均质l min~2 min。 （3）液体样品增加均质器拍打方式。 | ||||||
6 | 步骤
| / | 稀释及培养 | 新增： 6.2.3 经特殊技术(如包埋技术）处理的含乳酸菌食品应按照相应技术/工艺要求进行稀释。 | ||||||
7 | 双歧杆菌计数
| 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至 48℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使混合均匀。36 ℃±1 ℃厌氧培养72 h±2 h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。 | 双歧杆菌计数 | 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃~50℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基倾注人平皿15 mL~20 mL.转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃士1℃厌氧培养，根据双歧杆菌生长特性一般选择培养48 h,若菌落无生长或生长较小可选择培养至72 h.培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。 | ||||||
8 | 嗜热链球菌计数 | 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MC培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养72 h±2 h，培养后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2 mm±1 mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。 | 嗜热链球菌计数 | 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃～50℃的MC琼脂培养基及时倾注入平皿15 mL~20 mL转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃±1℃有氧培养，根据嗜热链球菌生长特性，般选择培养48 h，若菌落无生长或生长较小可选择培养至72 h。嗜热链球菌在MC琼脂培养基平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2 mm±1 mm,菌落背面为粉红色。 | ||||||
9 | 乳杆菌计数 | 根据待检样品活菌总数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72 h±2 h。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。 | 乳杆菌计数 | 根据待检样品活菌总数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃~50℃的MRS琼脂培养基倾注人平皿15 mL~20 mL.转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃士1℃厌氧培养,根 据乳杆菌生长特性，一般选择培养48 h.若菌落无生长或生长较小可选择培养至72 h。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。 | ||||||
10 | 菌落计数 | 注：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU）表示。6.3.1选取菌落数在30 CFU~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，,代表一个平板菌落数。 6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 | 菌落计数 | 见GB 4789.2菌落计数部分。 | ||||||
11 | 6. 4 结果的表述 | 6.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克或每毫升中菌落总数结果。 6.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算： N=∑C/（n1+0.1n2）d……（1） 6.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 6.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最di的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 6.4.5若所有稀释度(包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最di稀释倍数计算。 6.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU~300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最jie近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 | 结果的表述 | 见GB 4789.2计算方法部分。 | ||||||
12 | 菌落数的报告 | 6.5.1菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入"原则修约，以整数报告。 6.5.2菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入"原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入"原则修约后，采用两位有效数字。 6.5.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。 | 菌落数的报告 | 见GB 4789.2菌落总数的报告部分。 | ||||||
13 | 纯培养 | 挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板,乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36℃±1℃ 厌氧培养48 h。 | 纯培养 | 挑取3个或以上单菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，置36℃士1℃有氧培养48 h,乳杆菌属接种于MRS琼脂平板置36℃士1℃厌氧培养48 h。 | ||||||
14 | 涂片镜检 | 乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞,革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5 μm~2. 0 μ m，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。 | 涂片镜检 | 嗜热链球菌菌体镜下呈球形或球杆状，直径为0.5 μm~2.0 μm，成对或成链排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。乳杆菌属镜下菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性。 | ||||||
15 | 实时荧光PCR法鉴定 | 无 | 实时荧光PCR法鉴定 | 新增内容，见附录1。 | ||||||
16 | 培养基及试剂 | 无 | 培养基及试剂 | 新增： （1）稀释液
（2）DNA提取液
（3）10×PCR缓冲液
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17 | 培养基及试剂 |
| 培养基及试剂 |
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18 | 培养基及试剂 |
| 培养基及试剂 |
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19 | 培养基及试剂 | （1） 乳酸杆菌糖发酵管 按 0.5%加入所需糖类，并分装小试管，121℃高压灭菌15 min~20 min。 （2） 七叶苷培养基 将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解， 121℃高压灭菌15 min~20 min。 | （1）乳杆菌糖发酵管 按0.5%加入所需糖类，并分装小试管，121℃高压灭菌15 min。 （2）七叶苷培养基 将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121℃高压灭菌15 min。 |
三、变化解读
从对比表中不难看出，新版标准中，
（1）术语和定义，更加具体wan善，明确列出乳酸菌是“不能液化明胶、不产生吲哚、革兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性、硝酸还原酶阴性及细胞色素氧化酶阴性反应的细菌"；
（2）设备和材料中，设备增加了“厌氧培养装置：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置"，“实时定量PCR仪、恒温水浴锅或金属浴、离心机：离心力>10000×g"，“无菌平皿：直径90 mm"、“PCR管"，同时对冰箱的温度范围和移液器吸头的的量程及电子天平的精确度都做了wan善或调整；
（3）样品处理过程中，引入了“稀释液"，不再使用“生理盐水"；
（4）检验程序中，增加了“乳杆菌计数"的操作步骤，所有的培养时间均由原来的“72 h±2 h"改成“48 h-72 h"。
（5）稀释和培养过程中，新增了“经特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌食品应按照相应技术/工艺要求进行稀释"；
（6）培养基的温度，由“48℃"，改为“48℃~50℃"，培养基的倾注量，由“15 mL"改为“15 mL~20 mL"；
（7）菌落计数和结果表述及报告，均简化描述，直接与GB4789.2对接，采用“见GB 4789.2"相关部分这种表述方式；
（8）菌种纯培养，描述为“嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，置36℃士1℃有氧培养48 h，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板置36℃士1℃厌氧培养48 h"更加准确。
（9）菌种鉴定，引入实时荧光PCR法。
（10）除了新增鉴定方法外，对重要的培养基配方也进行了优化，常用的MRS、MC培养基，在配方和制备条件上都有更新，旧标准中所有的高压灭菌条件均为121℃高压灭菌15 min~20 min，新版标准中，全部改为“121℃高压灭菌15 min"。
四、新产品展示
顺应标准的更新，我们对相关培养基也做了变更，除正常销售现行标准（2016版）配套培养基外，还及时引入了新标准（2023版）中新增和有所变化的培养基，现将对应的产品信息列入下表（表2），相关人员可根据自己的实际情况选择购买、使用。表2 新旧标准中涉及的部分培养基及编号
序号 | 现行标准（2016版） | 新标准（2023版） | ||
名称 | 货号 | 名称 | 货号 | |
1 | MRS培养基 | HB0384-5 | MRS琼脂培养基 | HB0384-51 |
2 | 莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS 培养基 | HB0384-11 | 莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基 | HB0384-111 |
3 | MC培养基 | HB0383 | MC琼脂培养基 | HB0383-4 |
4 | 0.85%生理盐水 | / | 稀释液 | HB9272 |
