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维生素B12测定培养基试验方法及注意事项

发布时间:2021-04-02   点击次数:1044次

一、参考标准

 

  《GB5413.14-2010标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》

 

二、方法原理

 

  利用莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)对维生素B12的特异性和灵敏性,定量测定出试样中维生素B12的含量。

 

  在测定用培养基中供给除维生素B12以外的所有营养成分,这样莱士曼乳杆菌生长浓度(吸光度)就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素B12的含量呈正比的线性关系。以不同浓度标准溶液的维生素B12含量为横轴,以莱士曼乳杆菌生长浓度(吸光度)为纵轴,即可绘制标准曲线,根据标准曲线即可计算出试样中维生素B12的含量。

 

三、试验用品及预处理

 

 (1)培养基:维生素B12测定用培养基;

 

 (2)磷酸氢二钠、无水偏重亚硫酸钠、柠檬酸、生理盐水、25%乙醇、纯化水等;

 

 (3)容器:试管、移液管、容量瓶、量筒、玻璃棒、锥形瓶。

 

  注意事项:

 

  ①本方法所用试剂均为分析纯试剂,水为GB/T 6682规定的二级水。水的洁净程度对本试验至关重要,若水中有维生素B12残留或接触了有维生素B12残留的容器,将直接影响到试验结果。

 

  ②试验中使用的玻璃器具需洗净后在200℃烘至少2h,必要时可预先用1mol/L的稀盐酸浸泡再烘,充分去除容器中可能残留的维生素B12。

 

  ③使用的维生素B12测定培养基需确保不含有维生素B12,其他营养齐全。若自行配制培养基,需确保原材料中不含有维生素B12,制备过程不可污染维生素B12。

 

四、标准溶液的制备

 

 (1)维生素B12贮备液(10μg/mL):称取维生素B12标准品,用25%乙醇溶液定容至维生素B12浓度为10μg/mL。

 

 (2)维生素B12中间液(100ng/mL):用25%乙醇溶液将5.0mL维生素B12贮备液定容至500mL。

 

 (3)维生素B12工作液(1ng/mL):用25%乙醇溶液将5.0mL维生素B12中间液定容至500mL。

 

 (4)标准曲线工作液:分别吸取两个5mL维生素B12工作液于250mL和500mL容量瓶中,用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02ng/mL;低浓度溶液的浓度为0.01ng/mL。

 

  注意事项:

  

  ①标准溶液配制过程中使用的溶剂、容器必须确保无维生素B12残留。

 

  ②所有标准溶液要储存于冰箱内。维生素B12贮备液、中间液、工作液可保存三个月,标准曲线工作液临用前配制。

 

五、菌株活化及菌悬液制备

 

 (1)将莱士曼氏乳酸杆菌(ATCC 7830)菌株活化后,接种到乳酸杆菌琼脂培养基上,36±1℃培养24h。再转种2代~3代来增强活力。置2~5℃冰箱保存备用。每15d转种一次。

 

 (2)将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中,36±1℃培养18h~24h,以2000转/分钟离心2~3min,弃去上清液,加入10mL生理盐水,振荡悬浮混匀,再离心2~3min,弃去上清液,再加入10mL生理盐水,振荡悬浮混匀。再离心,弃去上清液。再加10mL生理盐水,振荡悬浮混匀。吸适量该菌悬液于10mL生理盐水中,混匀制成透光率为60%-80%的测试菌液(以生理盐水做空白,用分光光度计测550nm波长下的透光率)。

 

  注意事项:

 

  ①莱士曼乳杆菌初次复苏时活力较差,生长缓慢,必须连续转接传代2-3代或更多代数至菌株活力旺盛,方可用于试验。

 

  ②莱士曼乳杆菌可连续传代数十次仍然保持菌株特性稳定,可在传代5次之后继续使用(多数标准都规定传代次数一般不可超过5代,而莱士曼乳杆菌可以多次传代)。

 

  ③制备菌株过程需注意严格进行无菌操作,防止污染杂菌。

 

  ④制备菌悬液过程中的重复离心-去上清-生理盐水悬浮步骤目的为洗去活化培养基中的维生素残留,不可省略或减少清洗次数,若清洗不干净,可能会对试验结果造成不良影响。

 

六、样品处理

 

 (1)称取无水磷酸氢二钠1.3g,无水偏重亚硫酸钠1.0g,柠檬酸(含一个结晶水)1.2g,用100mL水溶解。

 

 (2)称一定量的样品 (到0.0001g),含维生素B12约50-100ng,用10mL的上述溶液混合后,再加150mL水,于121℃水解10min,冷却后调pH至4.5±0.2,再用水定容至250mL,过滤。移取滤液5mL,加入水20~30mL,调pH至6.8±0.2,用水定容至100mL。最终溶液中维生素B12的质量浓度约在0.01 ng/mL~0.02ng/mL,偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03mg/mL。

 

七、试验步骤

 

 (1)标准曲线制作:按下表顺序加入水、标准曲线工作液和维生素B12测定用培养基于试管中,做3个平行组。

试管

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

水(mL)

5

5

4

3

2

1

0

2

1

0

0.01ng/mL标准曲线工作液(mL)

0

0

1

2

3

4

5

0

0

0

0.02ng/mL标准曲线工作液(mL)

0

0

0

0

0

0

0

3

4

5

培养基(mL)

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

 

 (2)待测液的制作:按下表顺序加入水、样品溶液和维生素B12测定培养基于试管中,做3个平行组。

试管

1

2

3

4

水(mL)

4

3

2

1

待测液(mL)

1

2

3

4

培养基(mL)

5

5

5

5

 

 (3)灭菌:将所有试管置于121℃灭菌5min,灭菌结束后,迅速冷却至30℃以下。

  

  注意事项:不可灭菌时间过长或长时间在灭菌锅中保温,防止培养基中维生素成分过量降解;灭菌后的培养基宜当天使用。

 

 (4)接种:用滴管或移液器向上述试管中各滴加1滴(约50μL)测试菌液(其中标准曲线管中空白S1除外)。

 

 (5)培养:将试管放入恒温培养箱内,36±1℃培养19h~20h。

 

 (6)观察:培养结束后,对每支试管进行目测检查,未接种试管S1内培养液应是澄清的,如果出现浑浊,则测定无效。以接种空白管做对照,测定浓度标准曲线试管的透光率,2h后重新测定。两次结果透光率差值若小于2%,则取出全部检验管测其透光率。

 

  注意事项:若S1试管出现浑浊,可能是灭菌不彻底出现了污染;若S2出现明显浑浊,可能是培养基中有维生素B12污染或接种的菌液污染杂菌;两次测定浓度标准曲线的透光率差值若<2%,说明细菌生长已达峰值,可进行测定,反之则需继续培养至浓度,方可取出进行测定。

 

 (7)测定:用未接种试管(S1)作空白,将分光光度计透光率调到100%(或吸光度为0),读出接种空白试管(S2)的读数。再以接种空白试管(S2)为空白,调节透光率为100%(或吸光度为 0),依次读出其他每支试管的透光率(或吸光度)。

 

  用涡旋混合器充分混合每一支试管(也可以加一滴消泡剂)后,立即将培养液移入比色皿内进行测定,波长为550nm,待读数稳定30s后,读出透光率(或吸光度),每支试管稳定时间要相同。

 

  注意事项:在进行吸光度测定时,测量的OD值在0.2-0.8之间相对更准确,线性关系更好,若测得OD值超出范围,可进行倍数稀释再进行测定。

 

 (8)标准曲线制作及计算:以维生素B12标准品的含量为横坐标,透光率(吸光度)为纵坐标作标准曲线。

 

  根据待测液的透光率(吸光度),从标准曲线中查得该待测液中维生素B12的浓度,再根据稀释因子和称样量计算出试样中维生素B12的含量。透光率(吸光度)超出标准曲线管S3~S10范围的试样管要舍去。

 

  对每个编号的待测液的试管,用每支试管的透光率(吸光度)计算每毫升该编号待测液维生素B12的浓度,并计算该编号待测液的维生素B12浓度平均值,每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%,超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3,用于计算试样含量的数据是不充分的,需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3,重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液中维生素B12含量的平均值,以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为Cx。 用于计算试样中的维生素B12含量。

 

  维生素B12的含量按公式计算:X=Cx/m*f/1000*100

  注:X是试样中维生素B12的含量,单位为μg/100g;Cx是计算所得的维生素B12含量总平均值,单位为ng;m是试样的质量,单位为g;f是稀释倍数。

 

  以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留两位有效数字。

 

八、实验现象及标准曲线制作

 

 (1)实验现象:S3-S10试管呈梯度浑浊

 

 (2)标准曲线制作

 

九、试验关键点总结

 

 (1)试验用使用的玻璃容器、水、培养基等必须确保无维生素B12残留,整个试验过程操作要注意不能污染维生素B12,否则会导致标准曲线线性关系差或做不出标准曲线;

 

 (2)标准溶液制备过程中必须称量、定容,若配制的标准溶液误差过大会直接影响最终测定结果;

 

 (3)使用的莱士曼乳杆菌要连续进行传代至活力旺盛,且无杂菌污染;在进行菌体离心-悬浮清洗的重复操作时,需确保清洗干净,不能有活化培养基残留,残留的培养基中可能含有维生素B12,对试验结果造成不良影响;

 

 (4)进行OD值测定时,尽可能保证测得吸光度范围在0.2-0.8之间,若超出此范围,可使用空白培养基进行倍数稀释后再进行测定。

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