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定量菌株菌悬液制备方法

发布时间:2020-11-24   点击次数:526次

在进行培养基的验收,检验培养基的灵敏度、生长率时,都需要用到定量菌株。细菌的个体很小,肉眼无法直接看到,我们所看到的培养基平板上的菌落、浑浊的液体培养基,都是数以亿计的细菌集合体。在初次进行低浓度定量菌株菌悬液(10-100CFU/mL或20-200CFU/mL)制作时,通常都会感觉无从下手。

 

下面就为大家介绍常用的定量菌株菌悬液制备方法:十倍稀释法。

 

1、将生理盐水(或磷酸盐缓冲液等)分装至试管中,每支装量为9mL(百倍稀释可用10mL,特殊情况也可使用9mL做近似百倍稀释),进行灭菌处理(121℃灭菌15-30min即可);

 

注:在进行厌氧菌(如生孢梭菌,产气荚膜梭菌)稀释时,选用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液做为稀释剂效果更佳;若不在厌氧环境中操作,从开始稀释至使用菌悬液结束要控制在15min以内,时间过长会导致菌体死亡。

 

2、将灭菌后装有9mL生理盐水的试管编号1,2,3,4,5,6,7,8。

 

3、将一定量的菌加入至编号1的试管中制成稀释梯度菌悬液(通常称为10-1梯度),使用旋涡振荡器混匀。

 

4、吸取1mL10-1梯度菌悬液至编号2的试管中,混合均匀,就得到了第二稀释度的菌悬液(通常称为10-2梯度,若吸取10-1梯度菌悬液100μL至10mL生理盐水管中,即为百倍稀释,可以直接得到10-3梯度菌悬液)。

 

5、以此类推,可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度菌悬液,每一支管的含菌量都是前一直管的1/10,第8支管的菌液浓度就是第1支管的千万分之一了,如果这支试管含菌量是109CFU/mL,第8支管就可以得到100CFU/mL左右浓度的菌悬液了。

 

现在稀释方法有了,那么如何制备首支试管的菌悬液及确定首支试管中菌液的浓度呢?一般采用以下四种方法:

 

1、麦氏比浊法

将一定量培养好的细菌转移到首支试管中(可以用菌液,可以挑取菌落),制备成约5麦氏浊度的均一浑浊的菌悬液(约109CFU/mL),稀释即可。

优点:新手可直接上手操作

缺点:不同细菌体积大小有差别,有些芽孢菌容易聚成团块不易制得均一悬液;不适用于真菌孢子悬液制备;

注意事项:不同细菌的麦氏浊度与浓度之间存在差异,*试验之前需要先进行验证;麦氏浊度无法区分细菌死活,因此使用新活的菌制备;真菌(酵母菌)体积较大,同等浊度下浓度约为细菌的1/20。

 

2、吸光度法

细菌在600nm波长处具有大吸光度,在一定浓度下,细菌的浓度与OD600nm呈正比关系,因此可以通过测量OD600nm值来确定菌悬液浓度。此方法更常用于测定菌液浓度(观察细菌生长曲线),也可在制备105-107CFU/mL的菌悬液时使用,不适用于低浓度菌悬液制备。

 

3、菌液稀释法

将菌株接种至非选择性肉汤培养基中过夜培养,吸取1mL培养物至9mL生理盐水中制成10-1梯度菌悬液(约108CFU/mL),稀释至10-6或10-7即可得到10-100CFU/mL菌悬液。

优点:操作简单

缺点:菌数不稳定,受细菌种类、培养基影响较大;仅适合均匀浑浊生长的细菌或真菌;若培养过程发生污染,不易察觉。

注意事项:不同菌株生长时间不同,在不同培养基中生长浊度也不同,如大肠埃希氏菌在TSB中过夜培养即可,乳酸菌通常需在MRS肉汤中培养48-72h,酵母菌需在SDB培养基中培养3-5天。

 

4、菌苔稀释法

从平板或斜面上挑取一定量的菌苔(2-3mm单个菌落,菌落偏小可多挑几个菌落)至9mL生理盐水中振荡均匀,制成10-1梯度菌悬液(约108CFU/mL),稀释至10-7或10-8即可得到10-100CFU/mL菌悬液。

优点:操作简单,相比较于其他稀释方法,优势就是更容易准确控制菌数浓度;适用范围广,细菌、真菌均可采用此方法制备菌悬液。

缺点:需要尝试和经验

注意事项:不同菌株制成的菌悬液浓度同样存在差异,初次进行特定菌株稀释时需要做验证;一般非芽孢细菌制成的10-1梯度菌悬液约为108-109CFU/mL,而芽孢菌和酵母菌制成的10-1梯度菌悬液约为106-107CFU/mL。

 

总结:初次进行菌液制备时,可以选用方法1和方法4,多做几个稀释度测试,熟练有经验后使用方法4进行菌液制备,可轻松准确制得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL浓度菌悬液。

制备好的菌悬液可在验证过的时间内使用,使用时间一般与稀释剂有关,若使用了含蛋白胨的稀释剂,放置时间过长会出现细菌增殖的情况。一般情况下:

a.普通细菌建议在45min-2h内使用。

b.厌氧菌建议在15min内使用,

c.用生理盐水制备的霉菌的孢子悬液可在2-8℃放置1个月至更长时间。

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