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培养基灭菌后颜色变深的原因探究及预防措施

发布时间:2020-08-13   点击次数:145次

一、灭菌后颜色变深的原因

    葡萄糖是微生物培养过程中常用的有效碳源,但含葡萄糖的培养基经高温灭菌后,容易产生有害色素,其色素成分比较复杂,俗称焦糖色,主要是还原糖与氨基酸物质高温条件下发生的美拉德反应所致。

    下面大概介绍一下这种反应的机理:

    1912年法国化学家路易斯﹒卡米拉﹒美拉德在实验中偶然发现:羰基化合物(还原糖)的羰基可以与氨基化合物(氨基酸/多肽/蛋白质)中的氨基发生反应,该反应经过一系列复杂历程最终生成棕黑色的大分子物质类黑素或称拟黑素,该羰氨反应又称美拉德反应。

    经过各国学者多年研究,目前公认的美拉德反应机理可分以下三个阶段:

    起始阶段:还原糖与氨基酸或蛋白质发生缩合反应,生成具有亚胺或甲亚胺特性基团的有机化合物,即席夫碱;席夫碱环化生成氨基糖;氨基糖经重排生成1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。

    中间阶段:在酸性条件下,1-氨基-1-脱氧-2-酮糖经1,2-烯醇化反应,生成5-羟甲基糠醛;碱性条件下,1-氨基-1-脱氧-2-酮糖经2,3-烯醇化反应,生成还原酮类和脱氢还原酮类;1-氨基-1-脱氧-2-酮糖经降解反应生成醛类和吡嗪类等化合物。

    最终阶段:该阶段反应较为复杂,历程尚未完全明确,大致是中间阶段的产物与氨基化合物聚合反应生成高分子结构不明的类黑素,此外还有一系列中间体还原酮及挥发性杂环化合物生成。

二、美拉德反应的危害

    有研究表明,美拉德反应的反应速率随温度的增长呈现急剧升高的趋势,且美拉德反应部分中间产物和最终产物具有抑制微生物生长的作用,因此在微生物发酵工业中为避免还原糖类碳源与氨基化合物类氮源在高温下发生美拉德反应,通常将碳源和氮源分开灭菌,待冷却后再将其混合进行微生物发酵,而该工艺手段通常存在灭菌能耗较高、设备投入成本较大的问题。同时,美拉德反应产物还具有人们不需要的色泽和一定的致癌性,因此目前关于降低或抑制美拉德反应的文献报道主要集中在食品、医药等领域,而在微生物发酵领域的相关报道较少。

三、预防措施

    有人在实际工作中发现微量焦糖对许多细菌和酵母菌有明显的抑制作用,建议在配制细菌或酵母菌的含糖培养基时不宜采用高温灭菌手段,应采用过滤除菌方法。有报道称,采用亚硫酸钠可部分抑制美拉德反应,但亚硫酸钠本身有抑菌作用,在微生物培养中不能借鉴,而过滤除菌操作繁琐,还有人专门研究,将KH2PO4与葡萄糖一起灭菌在pH5.5时单独灭菌或与非氨类的无机盐共同灭菌,能减少色素的产生,但灭菌后的培养基还要再按各种要求调整pH,势必又会引入未知的杂菌,这种方法也缺乏可操作性。

    基于上面的理论知识,结合实际工作中的一些经验,我们提出:

   (1)对于一些含糖量高的培养基,一定要严格控制灭菌温度和灭菌时间,通常在115℃灭菌20分钟即可;

   (2)灭菌完毕,及时取出,不要在锅内放置很长时间;

   (3)灭菌时,锅内物品不要堆放过满,以免由于不同部位受热不均,造成不同瓶内培养基颜色差异。

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